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北京智鼠多宝生物科技有限责任公司
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天津医科大学/安定医院精神科强迫游泳

单次长时程应激对大鼠杏仁核激活的影响

黄庚娣1      方青1,2       王承展1,2        杨建立1,2**

1 ( 天津医科大学,天津,300070)

2 ( 天津市安定医院精神科,天津,300074)




    伤后应激障碍 ( PTSD)  是一种慢性的、衰竭性的精神障碍,发生于极端恐惧的经历后,其症状主要表现在高唤醒状态、惊吓反应增强、对创伤事件的再体验、对创伤相关线索的回避及情感麻木[1],其病理机制依旧不明。建立与人 PTSD 临床症状符合、有效的动物模型仍然是目前 PTSD 发病机制研究的关键[2 - 4]。单程长时应激模型( single prolonged stress paradigm,SPS ) 是PTSD 行为敏感化常用的应激模型之一,能够较好模拟 PTSD 发病过程及患者出现的核心症状,并广泛用于神经生物学研究中。SPS 模型是一个连续的过程,对实验动物依次进行 2 h 束缚( 躯干和四肢禁锢在塑料盒中,尾巴露在外面) 后,立即强迫性游泳 20 min( 20 - 24℃ ) ,然后休息 15 min 恢复,*后使用乙醚麻醉直到意识丧失[5 - 6]。

      杏仁核是主要边缘系统的皮层下**,对条件 性或非条件性的感官刺激进行植物神经、***及行为反应的情绪调控的关键脑区[7],主要包括基地外侧杏仁核( basolateral amygdala,BLA) 和中央杏仁核( central amygdala,CeA) ,其中 BLA 主要负责感觉信息的输入和处理,而 CeA 主要负责恐惧行为的表达[8]。研究表明,PTSD 的恐惧性记忆、易激惹、高唤醒等症状与大脑杏仁核、内侧前额叶皮层  ( medical prefrontal cortex,mPFC) 和海马密切相关, 其中,杏仁核可能是影响 PTSD 症状的关键核团[2]。影像学研究发现,PTSD 患者的杏仁核在条件性恐惧记忆的获得中显著激活[4]。因此,我们将应用 SPS 模型,观察大鼠 PTSD 样症状中形成过程中杏仁核的激活情况,探究 PTSD 的可能神经生物学机制。材料与方法

1. 1  实验动物

Sprague - Dawley( SD) 大鼠,♂,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,许可证号: SCX( 京) 2001 - 2003,体重平均在 200 - 220  g。采用 12  h 昼夜节律控制( 8: 00 - 20: 00) 。实验室湿度和温度均符合实验标准。实验开始前,动物在动物房适应性饲养 7 d,自由饮水,进食。

1. 2  实验材料和试剂

强迫游泳,北京智鼠多宝生物科技有限责任公司; 大鼠束缚容器,北京大学中国**依赖性研究所; 大鼠自发活动箱,上海吉量动物仪器公司; 高架十字迷宫,中国医科院协和**所。兔抗 FOS 一抗( Cell Signaling Technology,美国) ,Alexa Fluor 488 羊抗兔 IgG 二抗( Thermo Fisher Scientific,美国) 。

1. 3  PTSD 模型的建立

成年 SD 大鼠,在动物房适应性饲养 7 d 左右。首先使用硬质塑料盒(  使大鼠四肢及躯干束缚在瓶中,尾巴露在外面) 给予大鼠 2 h 的束缚,紧接着让其在 20 - 24℃ 水温进行 20 min 的强迫游泳,之后休息 15 min,*后用乙醚麻醉直至无抵抗。束缚期间温度和湿度都与正常饲养环境一致,待应激结束后分笼放回动物房饲养。

1. 4  旷场实验( open field test,OF)

旷场实验箱是由 75 × 75 × 40 cm ( 长 × 宽 × 高) 的木板制成,底 部均分为 25  个方格( 15 × 15cm) ,四周墙壁涂黑,紧靠墙的格称为外周区域, 其余全部是中央区域。实验测试出大鼠在箱中中间  格中行走的时间及在箱中的总路程,用以评价大鼠的焦虑状态和自发活动状态。每次测试 5 min,测试后用酒精湿布将迷宫擦拭干净,去掉遗留的气味。每次实验结束后均要用 10% 的乙醇将迷宫擦拭干净。

1. 5  高架十字迷宫( elevated plus maze,EPM)

EPM 是用来考察动物的焦虑状态。EPM 装置由两个开臂以及两个闭臂组成,每个臂长 50  cm,其中闭臂高 40 cm, 10 cm,迷宫高于地面 70 cm。每次实验时,将大鼠放在迷宫中间的平台上( 10 cm × 10 cm) ,面向开臂。5 min 内让大鼠在迷宫中自由探索。评价指标: 开臂时间、开臂次数、闭臂时间与闭臂次数,用以评价大鼠的焦虑状态。在测试过程中保持暗光操作,每次测试时间为 5  min,每次测完均要用酒精擦拭干净,去掉遗留的气味。

1. 6  样本准备和**荧光

将大鼠用****麻醉后用 0. 01  mol·L  1 的磷酸盐缓冲盐水( PBS) 冲洗至肝脏发白后再用 4% 的多聚甲醛固定,所需的甲醛溶液 pH 值为 7. 4。待大鼠完全僵硬住后,用咬骨钳剥离大鼠大脑,置于4% 的多聚甲醛溶液中 6 h 进行再次固定。随后将大鼠大脑置于 30% 蔗糖溶液中,进行脱水,干冰冷冻固定。使用切片机冰冻切片( 20 um) ,并储存在PBS 中。

做**荧光时,将脑片在 5% 牛血清中室温封闭 1 h,然后分别加入兔抗 FOS ( 1 ∶ 500) ,4 ℃ 过夜, TBST 漂洗 4 次 × 5 min 后 Alex Fluor 488 - 抗兔 IgG ( 1 ∶ 5000 )   室温避光孵育 2h,TBST  漂洗 4  次 × 5 min,然后将脑片裱在载玻片上并用抗荧光淬灭剂封片,*后使用荧光显微镜观察 FOS 蛋白表达变化。

     1.    7 统计分析

采用 SPSS 18. 0  统计学软件进行数据分析,计量资料数据用均数 ± 标准差( x珋± s) 表示,多组间均数比较用单因素方差分析( one - way analysis of variance,ANVOA) , P < 0. 05 为差异有统计学意义。

 结果

     2.     1 大鼠在经历 SPS 应激后的焦虑样行为改变

在旷场测试中,我们发现各组大鼠在中间区停留时间有统计学差异[F( 2,23)  = 11. 82,P < 0. 05,图 1A]。Posthoc 分析发现,同未造模动物相比,造模后第 14  d  大鼠在中央区停留时间显著缩短( P < 0. 05) ,造模后第 1d 则没有这种行为学表现。而且统计发现动物总的运动路程并未发生变化( P > 0. 05,图 1B) ,表明动物在中央区停留时间的变化不是由于动物的运动能力受损造成的。

在高架十字测试中发现,各组大鼠在开臂区停留时间以及开臂/( 开臂 + 闭臂) 有统计学差异,统计值分别为[F( 2,23)  = 4. 44  ,P < 0. 05,图 2A]和[F( 2,23)  = 5.07,P < 0. 05,图 2B]。Post - hoc 分析发现,同未造模组相比造模后第 14  d 大鼠在开臂区停留时间及开臂/( 开臂 + 闭臂) 指数显著降低( P< 0. 05) ,造模后第 1 d 大鼠和正常对照组相比却没有差异性改变。

                              




                                                图 1 不同处理组大鼠在旷场测试中的焦虑样行为

A: SPS 造模 1 d 和 14 d 后,大鼠在旷场中央区域的停留时间; B: 在旷场实验中,各组大鼠的运动路程; C: 大鼠旷场十字行为轨迹示意图。与未造模组相比,*   P < 0. 05,和正常对照组相比; n = 8。

2. 2 大鼠 SPS 应激后杏仁核 FOS 的表达变化

**荧光发现,不同处理组间的杏仁核 FOS 表达[F( 2,18)  = 5. 73,<  0. 05) 表达有显著性差异( 图 3) ,Post - hoc 分析发现同未造模动物相比,造模 14 d 后的大鼠 FOS 表达的表达含量显著增高( P < 0. 05) ,造模后第 1 d 大鼠和正常对照组相比却没有差异性改变。这些结果表明大鼠在经历了SPS 应激后杏仁核出现了延迟激活的现象。


                                        




                                              图 2 不同处理组大鼠在高架十字测试中的焦虑样行为

A: SPS 造模1 d 和14 d 后,大鼠在开臂的停留时间; B: SPS 造模1 d 和 14 d 后,大鼠的开臂/ ( 开臂 + 闭臂)

指数; C: 大鼠高架十字行为轨迹示意图。*  < 0. 05,和正常对照组相比; = 8。

                                             


                                                  图 3  不同处理对大鼠杏仁核脑区 FOS 表达的影响

A: 大鼠杏仁核脑区; B: SPS 造模 1 d 和 14 d 后,大鼠杏仁核脑区 FOS 的表达。*  < 0. 05,和正常对照组相比; = 6 - 7。


2  讨论

创伤后应激障碍( PTSD) 是一种复杂的精神**,临床表现形式多种多样,主要包括创伤经历再体验、回避行为、恐惧增强、易激惹等症状[5]。PTSD 动物模型经过创伤应激后,在生理和行为上表现出与 PTSD 患者很强的相似性,尽管,PTSD 动物模型不能完全模拟 PTSD 患者的所有相关症状,但仍然是揭示 PTSD **相关神经生物机制与症状的关键。目前,研究*多的是条件恐惧记忆模型和敏感化模型。由创伤应激导致的、时间依赖性增强的敏感化行为能够模拟 PTSD患者严重创伤事件后长期的行为及生理改变的关键特征,其中 SPS 模型是敏感化模型的一种,可较好模拟 PTSD 患者出现的恐惧记忆和焦虑反应增强、警觉性明显增高及相关神经***改变[6]。本研究采用 SPS 动物模型,SPS应激后大鼠发生延迟性的焦虑样行为,且呈现时间依赖性增强,符合临床上关于 PTSD 患反应敏感化的临床表现。

       杏仁核是中脑边缘系统的重要核团之一,在危险察觉、恐惧学习记忆及恐惧行为表达、情感事件记  忆的增强中发挥重要的作用。应激影响杏仁核的结 构和功能的改变,临床研究表明,在心境障碍患者, 尤其是抑郁症患者观察到杏仁核的神经解剖学改 变。其次,应激影响啮齿类动物杏仁核的神经可塑 性[9]。研究杏仁核的谷氨酸能神经递质可能在应 激作用中作为一个重要介质,调节杏仁核从而激活HPA 轴。而本研究发现大鼠杏仁核在遭受创伤后应激后 14 d 而不是 1 d 后激活,而且时间上是和焦虑样症状的发生时间是一致的。综合前人研究发 现,我们认为杏仁核可能参与了创伤后应激障碍症 状的发生过程,但是这二者之间的因果关系还需要 通过药理学、光遗传学等实验来进一步证明。

3 结论

本研究发现大鼠 PTSD 样症状同时伴随有杏仁核的激活,这可能参与了 PTSD 样行为的发生。这一发现使我们更好的认识 PTSD 症状的形成过程, 为今后 PTSD 的防治提供理论依据。






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