高血压脑出血模型大鼠不同时间段脑损伤
程度与 NO 含量和 C9 表达的关系
徐 莉
( 武汉市中南干休所医务室，湖北 武汉 430071)
摘要: 目的 研究高血压脑出血模型大鼠不同时间段脑损伤程度与脑组织 NO 含量和 C9 表达的关系。方法采用胶原酶法制备脑出血动物模型，将 96 只大鼠随机分为均等的 3 部分( 每部分 32 只) ，分别用于脑组织含水量测定、脑组织 NO 水平测定和 C9 表达检测。每部分又随机分为假手术组、模型组共 2 组 ，每组 16 只;每个小组 16 只大鼠再4个为一组，于造模后 2、12、24、72h 测各组大鼠脑组织含水量，脑组织 C9 表达，NO 含量。结果与假手术组比较，模型组 24 ～ 72h 脑组织含水量明显增多、脑组织 C9 表达增多、NO 含量减少。结论脑出血急性期的脑组织损伤程度与脑组织 NO 水平、脑组织 C9 表达有一定关系，临床**中改善脑循环、减轻炎症反应非常重要。
关键词: 高血压脑出血; NO; C9
中图分类号: Ｒ965. 1
文献标识码: A
文章编号: 2095-4646( 2014) 02-0103-03
近年来的研究表明脑出血(intracerebral hemorrhage，ICH)后血肿四周存在明显的炎症反应，炎症反应在脑出血继发性脑损伤中起着 十分重要的作用［1］。研究发现，补体系统在脑损伤炎症反应过程中起着重要作用［2］。本实验通过观察不同时间段高血压脑出血大鼠脑组织含水量、脑组织 C9 表达和 NO 水平，以探讨其与脑损伤程度的关系。
1 材料与方法
1． 1 实验材料
1． 1． 1 动物分组与造模
大鼠由湖北省动物实验中心提供，合格证号:SCXK( 鄂) 2011 ～ 012; 分组: 将 96 只大鼠随机分为均等的 3 部分( 每部分 32 只)，分别用于脑组织含水量测定、脑组织 NO 水平测定和 C9 表达检测。每部分又随机分为假手术组、模型组共 2 组，每组 16只; 每个小组 16 只大鼠再 4 个为一组，分别观察术后 2h、12、24、72h 四个时间点各项指 标，各组饲养条件相同。
高血压模型及脑出血模型的制备是通过应用 双肾双夹法来复制肾性高血压大鼠( ＲHＲ)模型。 剔除饲养过程期间出现脑卒中症状和体征的大 鼠。双肾双夹术后 2 ～ 3 月体质量300 ～ 350g /只 的高血压大鼠参照 Ｒosenberg［3］ 的方法，术前禁 食，可自由饮水，大鼠用****( 0． 1ml /100g) 注 射液腹腔麻醉后俯卧位固定于立体定位仪上，据图谱调整立体定位仪于注射点，头皮正中常规**后矢状位切开约 1． 5cm，暴露前囟点，用骨钻钻颅打孔( 直径约 1mm) 后 ，用微量进样器吸取胶原酶 2μl 迅速插入钻好的孔内，进针 5mm，注射时间不少于 15min，且留针 10min 后缓慢退针，钻孔处用骨蜡封闭，局部**后，缝合皮肤。
1． 1． 2 药品与仪器注射用尿激酶( 03290，南京南大药业有限责任公司) ，配制成 200IU /L 的溶液; 兔抗大鼠 C9 **组化试剂盒( 上海恒远生化试剂有限公司) ; NO试剂盒来自南京建成生物工程研究所。仪器: 大鼠脑立体定位仪，微量注射仪购于北京智鼠多宝生物科技有限责任公司; 电子天平( SAＲTOＲ2US，BP211D) ，德国生产; 8021 离心机( 上海手术器械厂) ; 752 分光光度仪( 上海精密仪器仪表有限公司) ; 半自动**组化仪( 常州市郝思琳医用仪器有限公司) ; 计算机病理图像管理系统 4． 10( 北航图像中心) 。
1． 2 方法
分别于术后第 2、12、24 及 72h，用 10% 水合氯醛麻醉大鼠后，迅速取出全脑，并用滤纸吸干脑表面液体和血迹，一部分置于中性福尔马林内固定作 HE 染色和**组化染色。另一部分用于脑组织含水量测定。
1． 2． 1 脑组织含水量测定［4］
将样本小塑料封口袋密闭，置 － 20 ℃ 冰箱内5 ～ 10 min 微冻硬后取出，置于薄膜隔开的干冰上，用薄刀片切取离胶原酶注入点 4mm 以外的2mm 厚冠状脑片，分离出血侧皮质及基底节，置浓硫酸处理过的称量杯内。用电子天平称取湿重后，置小玻璃瓶中，再放入05℃ 烤箱内烘烤 24 ～ 48h，直到称重为恒重。根据 Eliott 公式可以计算脑组织含水量( Water Content，WC) WC( % ) = ( 湿重 － 干重) ÷ 湿重 × 100%
1． 2． 2 脑组织 C9 表达测定分别于第 2、12、24、72h 手术，取脑组织，固定: C9 着色于细胞浆和细胞膜。采用兔抗大鼠C9 **组化试剂合，按试剂盒要求检测。在**组化阳性细胞胞浆及胞膜可见棕黄色颗粒。紧贴血肿周围但不包括血肿区切片，每张切片随机取4 个不重复高倍视野( 400 倍) ，计数每个高倍视野 下阳性细胞数。所有切片均在同等强度下、同等 放大倍数下分析，取每一时间点高倍视野下的阳 性细胞数平均数，结果用 x珋± s 表示。
1．2．3 NO 测定
分别于第 2、12、24、72h 手术，微冻硬后取出，置薄膜隔开的干冰上，分离出血侧皮质及基底节，4℃下用预冷的匀浆介质制备成 10% 的脑匀浆置 3000r /min 离心 15min 后，取脑匀浆上清液，按硝 基还原酶法测定 NO 的含量，严格按照试剂盒说明书进行操作。
1．3 统计方法
数据以 x珋± s 表示，SPSS 17． 0 统计分析。
2 结 果
2．1大鼠脑组织含量变化从表 1 可见，与假手术组相比，ICH 组脑组织含水量从 2h 开始增加，12h 增加较为明显( P ＜ 0. 05) ，24 ～ 72h 增加*明显( P ＜ 0. 01) 。
2． 2 大鼠脑组织 C9 表达结果
脑出血后 2h 血肿周围可见少量 C9 表达，阳 性细胞为小胶质细胞( P ＞ 0. 05) ，脑出血后 12h 增加明显，24h 达到高峰( P ＜ 0． 01) ，主要为小胶 质细胞和少量的神经元细胞，血管内皮细胞亦可 表达，一直持续到 72h。可见，脑出血后 24 ～ 72h， C9 的表达处于高峰，与假手术组比较有显著性差 异。见表 2。
2． 3 大鼠脑组织中 NO 含量的结果 与假手术组比较，ICH 组大鼠 2h 脑组织 NO 含量已有下降，12h 已有显著性差异( P ＜ 0． 05) ， 24 ～ 72h 处于低水平( P ＜ 0． 01) 。
3 讨 论
在脑出血的病理发展过程中，脑组织继发性 损伤是脑出血病情加重、预后**的重要因素［5］。 出血性脑损伤的炎性反应，由白细胞粘附血管壁， 血-脑屏障遭破坏、炎性细胞侵入脑实质等组成。脑出血时炎性因子表达增加，能增加脑水肿、血管 壁通透性。NO 是由血管内皮细胞分泌的强有力 的血管舒张因子，可以直接作用于平滑肌细胞，通 过激活鸟苷酸环化酶，使细胞内的游离钙水平降 低，平滑肌松弛。脑部血流是由内皮衍生的 NO 调节 的，NO 还是红细胞聚集性的重要影响因 素［6］。NO 可通过抑制白细胞-内皮细胞粘附、阻 止血小板凝集和疏通组织灌注等限制缺血性脑损 伤［7］。本实验中与假手术组比较，ICH 组大鼠 2h 脑组织 NO 含量已有下降，12h 已有差异( P ＜ 0． 05) ，24 ～ 72h 处于较低水平( P ＜ 0． 01) ，说明脑出 血急性期 NO 下降是导致红细胞聚集，进而溶解 破裂、血肿形成的重要因素，因而**中改善微循 环是重要环节。脑出血后脑水肿主要分为血管源 性脑水肿和细胞毒性脑水肿，血管源性脑水肿常 发生于脑出血早期，它的形成原因主要有血管壁 通透性增加、血管损伤、血浆外渗及血脑屏障破 坏［8］。脑出血后补体级联被激活，C9 表达增加， 补体 C9-C5b 组成膜攻击复合物( MAC) ，MAC 是大分子复合物，可形成跨膜孔道使大分子物质和 离子双向流动，进而攻击神经胶质细胞、神经细胞 和血肿内的红细胞，加剧 ICH 后脑损伤，MAC 也 可直接插入星形胶质细胞、神经元和内皮细胞，破 坏血脑屏障。实验表明脑出血后 24 ～ 72h，C9 的 表达处于高峰，说明在脑出血后脑水肿尤其在血 管源性脑水肿中补体系统对于其发展起着重要作用。