竹节参总皂苷对不同时间段脑出血模型大鼠脑损伤的保护作用
闵静1，严菊华1，敖明章2( 1. 湖北职业技术学院医学院，湖北孝感432000; 2. 华中科技大学生命科学与技术学院)
摘要: 目的研究竹节参总皂苷( TSPJ) 对脑出血大鼠脑损伤不同时间段的影响。方法采用胶原酶法制备脑出血动物模型，将48 只大鼠随机分为假手术组、模型组、TSPJ 低、高剂量组共4 组，每组12 只; 造模后6h 灌胃给药，每12h 1 次，于造模后12、72h 测各组大鼠脑组织含水量，超氧化物歧化酶、丙二醛含量，IL-6、TNF-α 水平。结果与模型组比较，72h 高剂量TSPJ 组脑组织含水量减少，超氧化物歧化酶活性增高，丙二醛含量下降，IL-6、TNF-α 水平下降，12h 时TSPJ 高剂量组超氧化物歧化酶活性增高，TNF-α 下降; 丙二醛、IL-6 含量变化不明显。结论TSPJ 能减轻出血性脑损伤，对受损脑组织发挥保护作用，且有时间依赖性。
关键词: 竹节参总皂苷; 脑出血; 脑水含量
中图分类号: Ｒ965. 1 文献标识码: A 文章编号: 2095-4646( 2014) 03-0194-03
脑出血( intracerebral hemorrhage， ICH) 是一种急症重症，严重威胁人们的健康; 脑出血后血凝块回缩，血脑脊液屏障的破坏，血肿周围缺血，组织炎症反应等因素都可造成脑组织的水肿，从而引起功能障碍［1］。竹节参总皂苷( total saponins ofpanax japonicus，TSPJ) 具有**化瘀作用，本实验通过观察12h 和72h 两个时间段TSPJ 对脑出血大鼠脑组织超氧化物歧化酶( SOD) 活性、丙二醛( MDA) 及IL-6、TNF-α 含量的影响，研究其不同时间段的效果及机理。
1 材料与方法
1． 1 实验动物
健康雄性SD 大鼠，体质量为240 ～ 280g，清洁级，由湖北省动物实验中心提供，合格证号:SCXK( 鄂) 2011 ～ 012; 分组: 大鼠随机分为4 组，假手术组、模型组、TSPJ 低剂量组( 100mg /kg) 、TSPJ 高剂量组( 200mg /kg) ，每组12 只，分别观察术后12、72h 两个时间点各项指标。TSPJ 组术后6h 灌胃给药，假手术组及模型对照组灌胃等量生理盐水，以后12h /次TSPJ 组灌胃给药，而假手术组及模型对照组灌胃等量生理盐水，各组饲养条件相同。
1． 2 药品与仪器
竹节三七样品采自湖北恩施，采用醇提取法，**称取样品50mg，定容于50ml 容量瓶，**吸取样品液2ml，置50ml 容量瓶中定容，摇匀。由华中科技大学生命科学院天然产物实验室通过标准品检测，TSPJ 净含量为33． 3%，用前配成悬浊液，置4℃ 冰箱保存备用。Ⅶ型胶原酶，美国Sigma公司产品; 注射用尿激酶( 批号03290，南京南大药业有限责任公司) ，配制成200 IU / L 的溶液;SOD 试剂盒、MDA 试剂盒( 上海恒远生化试剂有限公司) ; IL-6、TNF-α 试剂盒，北京福瑞生物工程有限公司。仪器: 大鼠脑立体定位仪，微量注射仪购于北京智鼠多宝生物科技有限责任公司; 电子天平( SAＲTOＲ2US，BP211D) ，德国生产; GF-D200半自动生化分析仪( 山东高密彩虹分析仪器有限公司) ， 8021 离心机( 上海手术器械厂) ; 752 分光
光度仪( 上海精密仪器仪表有限公司) 。
1． 3 模型制备
参照Ｒosenberg 等［2］的方法，根据包新民大鼠脑立体定位图谱［3］确定尾状核的位置: 术前禁食，自由饮水，大鼠经****( 0． 1ml /100g) 腹腔麻醉俯卧位固定于立体定位仪上，据图谱调整立体定位仪于注射点，头皮正中常规**后矢状位切开约1． 5cm，暴露前囟点，用骨钻钻颅打孔( 直径约1mm) ，用微量进样器吸取胶原酶2ml，迅速插入已钻好孔内，进针5mm，注射时间不少于15min，留针10min 后缓慢退针，钻孔用骨蜡封闭，局部**后，缝合皮肤，假手术组注射2ml 的生理盐水，手术过程同出血组。
1． 4 检测方法
1． 4． 1 脑组织含水量测定
分别于术后第12h 及第72h，过量麻醉大鼠，快速断头取脑组织，用滤纸吸干脑表面液体和血迹，小塑料封口袋密闭全脑，电子天平称湿重，然后放入80℃烤箱中，72h 后称干重。脑含水量计算公式: ［( 湿重－ 干重) /湿重］× 100%。
1． 4． 2 SOD 活性、MDA 含量测定
各组动物再分两组分别于术后第12h 及第72h，过量麻醉大鼠，快速断头取脑组织，微冻硬后取出，置薄膜隔开的干冰上，分离出血侧皮质及基底节，4℃下用预冷的匀浆介质制备成10%的脑匀浆置3000r /min 离心15min 后，取上清液按试剂盒方法操作。SOD 活性测定: 通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基，进而氧化羟胺形成亚硝酸盐，在550nm 处测其吸光度，通过公式计算。MDA 含量的测定: 通过过氧化脂质降解产物中的MDA 可与硫代***酸缩合，形成红色产物，在532nm 测吸光度。
1． 4． 3 IL-6、TNF-α 测定
分别于术后第12h 及第72h 手术，取脑匀浆上清液，按放免试剂盒说明书，加入分离剂后充分混匀，放室温20min，离心，吸上清，生化分析仪上测放射性，以B /T 计算NSB、SO 结合百分率，以B /B0 计算标准及待测样品结合百分率，并查出样品值。
1． 5 统计方法
以SPSS 17． 0 统计分析，数据以珋x ± s 表示，各组间比较采用t 检验，P ＜ 0. 05 为差异有统计学意义。
2 结果
2． 1 TSPJ 对脑水肿的影响
从表1 可见， 12h 时TSPJ 组脑出血后的脑组织含水量无明显影响， 72h 时高剂量组TSPJ 组脑出血后的脑组织含水量减少，和模型组比较有显著性差异( P ＜ 0． 05) 。
2． 2 TSPJ 对大鼠脑组织SOD 活性、MDA 含量的影响
模型组与假手术组各时间段大鼠脑组织SOD 活性、MDA 含量差异极显著( P ＜ 0． 01 ) ;与模型组比较，TSPJ 高剂量组12h 时SOD 活性有明显差异( P ＜ 0． 05 ) ，MDA 含量无明显差异，72h 高剂量TSPJ 组SOD 活性增高，差异极显著( P ＜ 0． 01 ) ，MDA 含量下降，差异性显著( P ＜ 0． 05) ，见表2。
2．3 TSPJ 对大鼠脑组织中IL-6、TNF-α 含量的影响
与假手术组比较，模型组大鼠IL-6、TNF-α 水平增高，差异有非常显著性( P ＜ 0． 01) ; 与模型组比较，12h 时低剂量组IL-6 无明显差异，高剂量组TNF-α 有差异( P ＜ 0． 05) ，72h 时高剂量TSPJ 组大鼠IL-6、TNF-α 水平下降( P ＜ 0． 05) ，见表3。
3 讨论
在脑出血的病理发展过程中，脑组织的继发性损伤是脑出血病情加重、预后**的主要因素［4］。出血性脑损伤的炎性反应，由白细胞粘附血管，血-脑屏障遭破坏，炎性细胞侵入脑实质等组成。脑出血时炎性因子表达增加，增加脑水肿、血管壁通透性、炎细胞浸润。IL-6 介导白细胞与内皮细胞粘附，TNF-α 能促进中性粒细胞浸润并释放蛋白水解酶，与神经元损害密切相关［5］。实验中可以看出TSPJ 组脑出血后的脑组织含水量减少，与模型组有显著性差异( P ＜ 0． 05) ; 并且72h 时TSPJ 组大鼠脑组织丙二醛含量降低( P ＜0． 05) ，超氧化物歧化酶的活力增高，高剂量TSPJ组极明显( P ＜ 0． 01) ， 72h 时高剂量TSPJ 组IL-6、TNF-α 水平明显下降，与模型组有显著性差异( P＜ 0． 05) ，推测脑出血12h 内，血肿中的红细胞破裂或被吞噬细胞吞噬，含铁血黄素游离，炎细胞浸润，炎症反应较明显，脑出血第72h 血肿经循环吸收**，炎性细胞数量逐渐减少，炎症因子减少，所以此时血肿变小，炎症反应减轻，超氧化物歧化酶的活力增高，丙二醛降低， IL-6、TNF-α 水平明显下降。因而72h 时效果明显除与**作用有关外，还与**不同发展阶段有关，所以****和研究还要考虑不同时间段病变区别及对药效的影响。总而言之，TSPJ 能在一定程度上减少损伤时自由基生成，抑制脂质过氧化反应，增加体内自由基**剂如超氧化物歧化酶，减少炎症因子，从而对颅脑损伤有一定保护作用。