中国运动医学杂志2016 年4 月第35 卷第4 期Chin J Sports Med，Apr. 2016，Vol.35，No.4
跑台运动对兔前交叉韧带断裂后膝关节软骨的影响
钟名金刘振龙张继英李玳胡晓青敖英芳
北京大学第三医院运动医学研究所（北京100191）
摘要目的：建立一种可有效用于研究兔前交叉韧带（ACL）断裂后运动对软骨影响的实验运动模型，进而研究早期运动对兔ACL 断裂后关节软骨的影响。方法：45 只成年新西兰大白兔（4~5 月龄，重2.5~3kg），随机平均分为：I 组，假手术自由活动组（Sham 组）；II 组，前交叉韧带切断（ACL transection）自由活动组（ACLT 组）；III 组，前交叉韧带切断跑台运动组（ACLT with exercise，ACLT+Ex 组）。运动组在实验跑台上定期运动，运动始于术后第5 天，运动强度为5 天/周，10 分钟/天，跑台速度为0.3 英里/小时（约8 米/分钟）。分别于术后第2、3、4 周每组处死5 只兔子， 对兔膝关节股骨髁软骨进行印度墨汁染色大体观评分、组织学和二型胶原**组化染色并使用国际骨关节炎研究会（OARSI）软骨损伤评分系统进行软骨损伤评估。结果：术后2 周，Sham 组、ACLT 组和ACLT+Ex 组未见明显软骨损伤；术后3 周、4 周，Sham 组软骨未见明显损伤退变；ACLT 组和ACLT+Ex 组均出现软骨损伤，在大体观评分和OARSI 分级、分期、总分上分别与Sham 组存在显著统计学差异；ACLT 组与ACLT+Ex 组在大体观评分和OARSI 软骨损伤评分上无统计学差异。结论：跑台运动是可用于研究兔ACL 断裂后对关节软骨损伤研究的有效实验运动模型；兔ACL 断裂后早期出现关节软骨损伤，但与笼养自由活动相比，实验跑台运动对关节软骨损伤进程无影响，表明ACL 断裂后早期进行合理运动与康复不会加重膝关节软骨损害。
关键词前交叉韧带断裂；软骨损伤；运动；实验跑台
前交叉韧带（anterior cruciate ligament，ACL）断裂是临床中十分常见的运动创伤。ACL 断裂后造成膝关节活动时失去维持胫骨前向稳定的限制力， 关节不稳引发关节软骨退变加剧， *终导致骨性关节炎（Osteoarthritis，OA） 的发生[1]。文献报道，ACL 断裂后OA 的发生率、严重程度与伤后关节活动方式和强度有密切关系[2]。动物模型可以很好地反映ACL 断裂后关节软骨损伤的病理变化过程。兔膝关节与人膝关节的解剖相类似，并且兔易获得、易饲养和经济成本低，因此兔前交叉韧带切断（anterior cruciate ligamenttransection，ACLT）是模拟ACL 断裂和进行相关实验研究的合适模型[3]。实验模型原则上应该尽可能模拟临床患者的日常活动或运动情形。既往文献报道的关于兔ACL 断裂后的活动只限于笼养自由活动[4]，不能反映临床上人的日常活动和运动， 也无法进一步研究运动条件下软骨损伤的病理变化。因此需要建立一种用于兔ACL 断裂后的运动模型， 来模拟ACL 断裂后的运动，进而观察ACL 伤后运动对关节软骨的影响。本研究通过切断兔ACL 并予以跑台运动来模拟ACL 断裂后的运动， 观察兔ACL 断裂后早期运动对关节软骨的影响，从而为ACL 断裂后进行早期合理运动和康复提供一定的理论基础。
1 材料与方法
1.1 实验动物
由北京大学医学部动物部提供成年新西兰大白兔，4~5 月龄，体重2.5~3 kg，共45 只，由专业饲养员分笼饲养，所有动物均可充分获得食物和饮用水。
1.2 兔运动跑台及运动方案
实验跑台采用兔运动训练跑台（北京智鼠多宝生物科技公司）。根据实验设计要求，跑台主要由跑道、电机、操作台、升降机等构成。跑台内含3 个跑道，规格为1560 mm×996 mm×280 mm， 长度适用于兔的奔跑，跑道速度由电动马达驱动，速度可无级调整，范围为1~40 米/分（图1）。兔运动开始于手术后第5 天，每周5天，每天10 分钟，跑台速度为0.3 英里/小时（约8 米/分钟）。Oyen-Tiesma 等[5]研究认为此运动方案符合兔的运动量， 可**有效地用于兔运动损伤的相关研究
中而不会产生任何相关并发症或继发性损伤。自由活动组**于饲养笼（550 mm×450 mm×400 mm） 内活动。
1.3 实验动物与分组
兔经过1 周的适应性笼养后， 随机均分为3 组：I组，假手术自由活动组（Sham 组）；II 组，前交叉韧带切断自由活动组（ACLT 组）；III 组，前交叉韧带切断跑台运动组（ACLT with exercise，ACLT+Ex 组）。每组分别于术后2、3、4 周处死兔子获取膝关节， 每次每组5 只兔子。
1.4 手术方法（图2）
采用耳缘静脉注射20%乌拉坦（5 ml/kg）对动物进行全身麻醉，将膝关节固定、备皮、**及铺巾，经膝关节内侧髌旁切口，逐层分离至打开关节腔，将髌骨向外侧脱位后屈膝下完全暴露前交叉韧带， 用眼科剪在韧带中段予以切断并剪除2 mm 韧带组织防止粘连**，行Lachman 试验确定韧带完全切断， 生理盐水冲洗关节腔，将髌骨复位，严密缝合关节腔及皮肤。假手术组动物采用相同的切口在相同条件下切开皮肤和打开关节腔，暴露前交叉韧带不予以切断，生理盐水冲洗后关闭伤口。为防止术后关节感染，术后予以每只动物肌注40 万单位的青霉素，连续3 天。
1.5 大体形态观察
解剖膝关节，充分暴露股骨髁，观察股骨內外髁软骨的大体形态， 进行印度墨汁染色后并采用如下评分系统进行评价[6]：1 分：软骨表面光滑，色泽光鲜，无墨汁残留；2 分：软骨表面裂隙，范围0~4 mm；3 分：软骨表面裂隙，范围4~8 mm；4 分： 软骨表面裂隙，范围大于8 mm；5 分：软骨全层磨损，深度0~2 mm；6 分：软骨全层磨损，深度2~5 mm；7 分：软骨全层磨损，深度大于5 mm。股骨内外髁软骨损伤墨汁染色的平均分代表股骨髁软骨损伤分值。
1.6 组织学和Ⅱ型胶原**组化染色
大体观察后将兔膝关节固定于4%的中性多聚甲醛固定溶液中，固定72 小时。标本经固定后自来水冲洗，用10%甲酸脱钙液进行脱钙，每日更换脱钙液至脱钙充分，标本用蒸馏水漂洗，至恢复中性PH。修整股骨内外髁软骨组织，经脱水、透明、浸蜡、包埋后，以5 μm/层切片， 行苏木精-伊红染色（hematoxylin and eosin，HE）、甲苯胺蓝染色（Toluidine Blue）。组织学评分采用国际骨关节炎研究会（Osteoarthritis Research SocietyInternational，OARSI）推出的关节软骨组织病理学评分系统[7]，此评分系统能准确评估软骨损伤情况。HE 染色主要用于观察软骨的层次结构， 甲苯胺蓝可以观察软骨蛋白多糖的含量。该评分系统根据软骨损伤严重性和深度将软骨损伤分为0~6 级（Grade0~Grade6）（表1），根据软骨损伤范围将软骨损伤分为0~4 期（Stage0~Stage4）（表2）， *终的OARSI 总分为分级与分期的乘积（0~24 分）（表3）。将股骨内外髁软骨损伤分级、分期和总分的平均分代表股骨髁软骨损伤分值。同时对软骨组织切片采用“二步法”进行II 型胶原COL.II）**组化染色用于观察软骨基质的II 型胶原变化。
1.7 统计学处理
数据采用中位数（*小值， *大值） 表示， 采用SPSS 18.0 软件进行统计学分析，两组中位数的比较采用非参数Mann-Whitney 检验进行，三组间两两比较调整了检验水准，P<0.05 差异有统计学意义。
2 结果
2.1 术后2 周软骨损伤情况
术后2 周，Sham 组、ACLT 组和ACLT+Ex 组软骨均未见明显损伤，软骨表面光滑，色泽鲜亮，无墨汁残留。HE 组织学染色表现为软骨结构清晰，软骨结构完整。甲苯胺蓝染色表现为软骨染色均一，糖原含量无减少。II 型胶原**组化染色未见II 型胶原丢失。软骨墨汁染色评分和OARSI 分级、分期及总分统计结果表明三组间无统计学差异（图3）。
