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北京智鼠多宝生物科技有限责任公司
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参苓散对脾阴虚痴呆模型大鼠海马区 BDNF、NGF 表达的影响

侯永春 严 孜1 ( 江西中医药大学江西 南昌 330004)

    目的    观察参苓散对脾阴虚痴呆( AD) 大鼠海马区脑源性神经营养因子( BDNF) 、神经生长因子( NGF) 表达的影响方法      48 只体重( 300 ± 20) g 的健康雄性大鼠随机分成空白组( 空白对照) 、阴虚组( 脾阴虚) 、AD 组( 脾阴虚 + AD) 和 组( 脾阴虚 + AD ) ,每组 12 只通过病证结合的方法建立脾阴虚 AD 大鼠模型组给予中药参苓散灌胃每日1 ml /100 g持续10 d其他各组每日予等体积生理盐水灌胃采用Morris 水迷宫测试各组大鼠学习记忆能力用疫组化( SP) 方法观察大鼠海马区BDNF 和NGF 的表达结果     ①  造模后阴虚组AD 组、 组与空白组对比逃避潜伏期明显延长穿越平台次数减少( P 0. 05 P 0. 01) ; 给予参苓散后组与阴虚组AD 组相比大鼠逃避潜伏期明显缩短穿越平台次数增多( P 0. 01) ; ②与空白组比较阴虚组AD 组大鼠海马 BDNFNGF 表达明显下调( P 0. 01) ; 而组大鼠海马 BDNFNGF 表达与阴虚组AD 组比较明显上调( P 0. 01) 。结论 参苓散能改善脾阴虚 AD 模型大鼠的学习记忆能力增加其海马区 BDNFNGF 表达

关键词 参苓散; 痴呆; 脑源性神经营养因子; 神经生长因子

中图分类号 749 文献标识码 A 文章编号 1005-9202( 2014) 03-0728-03; doi: 10. 3969 / j. issn. 1005-9202. 2014. 03. 075

老年性痴呆( AD) 是一种枢神经系统退行性**其进行性的认知功能障碍学习和记忆能力减退1中医发现这一病症与脾虚湿胜脑窍失养症状相似; 同时临床上也多用补脾益肾增智的方剂参苓散具有益心力除谬忘能饮食延年益寿的功效近几年来发现大脑海马区神经因子数量减少和功能障碍在脾阴虚 AD 发生与发展中起到越来越重要的作用2本研究观察参苓散对脾阴虚 AD 大鼠的学习记忆功能的改善作用用疫组化( SP) 方法观察大鼠海马神经因子表达的变化为防治脾阴虚 AD 病提供科学证据

1 材料与方法

1. 1

1. 1. 1 动物 选用清洁级健康雄性 SD 大鼠 48 只江西中医学院实验动物中心提供合格证号 2011-50体重( 300 ± 20) g环境温度( 25 ± 2) ℃ 自然昼夜节律颗粒饲料饲养自由饮水

1. 1. 2    药品与试剂    参苓散( 药包括茯苓人参甘草等份自配常规水煎药液含生药 3. 2 g / ml) 和伤阴药( 吴茱萸附子等常规水煎药液含生药 1 g / ml) 江西南华制药有限公司;   钠注射液江西科伦药业有限公司;   3-氨丙基-3-乙氧基甲硅烷( APES) ; 抗兔 SP 试剂盒中性磷酸盐缓冲溶液( PBS) ; 二氨基联苯胺( DAB) 显色剂( 均为中杉金桥) 。

1. 1. 3 仪器    2135 型石蜡切片机( Leica德国) 展片烤片机( 山东红旗仪器厂中国) DT10K 型电子天平( 江苏常熟长青仪器仪表厂中国) ,恒温箱兼培养箱( 上海医用恒温设备厂 中国) BX-41 型显微照相仪( OLYMOUS日本) DB001 型 Mor- ris 水迷宫( 北京智鼠多宝生物科技有限责任公司中国) 。

1. 2 方法

1. 2. 1    动物分组    48 只健康雄性大鼠称重后随机分成四组: 空白组( 空白对照) 、阴虚组( 脾阴虚) 、AD 组( 脾阴虚 + AD) 和组( 脾阴虚 + AD +) ,每组 12 只

1 江西中西药大学科技学院

**作者: 侯永春( 1979-) 讲师主要从事中药药理学研究

1. 2. 2 动物模型复制及给药

1. 2. 2. 1 脾阴虚证模型 首先对阴虚组AD 组和组大鼠参照经典的复合因素造模法3进行脾阴虚模型的建立分为脾气虚和脾阴虚两个阶段实验第 1  15 天为脾气虚阶段大鼠单日自由游泳达到耐力极限禁食饲料喂甘兰( 30 g / 只) ; 双日予猪油脂灌服; 空白组正常喂养予等量生理盐水灌服第 16  24 天为脾阴虚阶段在脾气虚的基础上每日增加伤阴药 1 ml /100 g 连续灌服而空白组大鼠仅予等体积生理盐水灌服

1. 2. 2. 2 脾阴虚 + AD 模型 AD 组组大鼠继续进行AD 模型4的建立 MILLIQ 水将 Aβ1 40稀释成 5 μg / μl37℃ 孵育1 w使其变为聚集状态备用大鼠经腹腔注射2%    钠( 45 mg / kg) 麻醉后固定到脑立体定位仪常规备皮**切开皮肤; 选择双侧海马为注射靶区取前囟后 3. 5 mm  中线旁 2. 0 m 门齿钩平面低于耳间线平面 3. 3 mm 处钻开颅骨暴露硬脑膜微量注射器自脑表面缓慢垂直进针至硬脑膜下2. 5 mmAD 各组每侧予以2 μl 淀粉样蛋白酶( Aβ1  40 ) 溶液缓慢注入留针以保证溶液充分弥散缓慢撤针缝合切口皮下注射抗生 防止感染; 空白组和阴虚组大鼠进行同样手术 仅注入等体积 MILLIQ 水术后继续喂养

1. 2. 3 药干预 术后第 4 天对组大鼠给予中药参苓散灌胃每日 1  ml /100  g持续 10  d而其余各组大鼠每日予等体积生理盐水灌胃

1. 2. 4  Morris 水迷宫试验   采用 Morris 水迷宫测试各组大鼠造模前造模后后学习记忆能力; 具体方法参照 Morris 等5的方法分别于 AD 造模术前造模术后第 3 天及结束后评价各组大鼠逃避潜伏期穿越平台的次数

1. 2. 5  标本制备  各组大鼠在进行行为学测试结束后立即以致死量 100 g / L 水合氯醛( 350 mg / kg) 腹腔麻醉后仰卧位固定于手术台上剪开胸腔暴露心脏从心尖插入灌注针至左心室同时剪开右心耳快速滴入 37℃ 生理盐水 300  ml无血污后改为滴入固定液 4℃ 的多聚甲醛 400 ml待大鼠尾巴完全僵直时迅速断头取出海马组织固定于 4% 多聚甲醛溶液中 12 24  h进行脱水透明及石蜡包埋冠状面连续切片厚度约3  μm用经多聚赖氨酸处理过的载玻片捞片晾干后置于 60℃的烤箱中烘烤备用

1. 2. 6 脑源性神经营养因子(  BDNF) 、神经生长因子(  NGF)  疫组化检测     采用 疫组化 SP 法检测 BDNF  NGF 的表达严格按照试剂说明书操作要求进行检测在海马区随机选择 8 个视野用显微图像分析系统下的目镜400 倍显微计数计算阳性细胞数平均数

1. 3  统计学方法   应用 SPSSV11. 5 软件进行分析计量资料 x ± s 表示组间两两比较采用多组定量资料的单因素方差分析 LSD 法

2. 1 定位航行试验      造模前各组大鼠定位航行试验逃避潜伏期无统计学差异( P  0. 05) ,具有可比性; 造模后阴虚组AD 组组与空白组对比逃避潜伏期明显延长( P  0. 05 或P  0. 01) 。给予中药参苓散灌胃后与阴虚组AD 组相比组逃避潜伏期明显缩短( P  0. 05) 。见表 1

 


 2. 2    空间探索试验     造模前各组大鼠空间探索试验穿越平台次数无统计学差异( P 0. 05) ,且有可比性造模后阴虚组AD 组组与空白组对比穿越平台次数明显减少( P 0. 01) ; 其中组AD 组与阴虚组比较穿越平台次数明显减少( P 0. 01) 。给予中药参苓散灌胃后与阴虚组AD 组相比组穿越平台次数明显增加( P 0. 01) 。见表 2


2. 3  各组大鼠 BDNFNGF 表达情况   与空白组比较阴虚组AD 组大鼠海马 BDNFNGF 表达明显下调( P  0. 01) ; 而组与阴虚组AD 组比较明显上调( P  0. 01) 。见表 3 1



    3 

AD 呈逐年上升的趋势至今还没有令人满意的方法 中** AD 给人们提出了新思路本研究结果表明参苓散灌服能够明显提高脾阴虚 AD 大鼠的学习和记忆能力改善认知功能

海马结构作为大脑边缘系统的重要组成部分在学习和记 忆等上等神经活动中起关键作用海马神经元损害可能是 AD 的重要病理基础之一神经营养因子是一类对神经有特异性的蛋白质BDNF 和 NGF 就是其中的代表随着对其深入研究人们发现它们具有明确的促进和维持神经细胞分化生长 和存活作用在改善认知功能方面也有重要作用6 8但中药方参苓散能否促进慢性脑缺血大鼠 BNF 的表达目前国内外未见报道本研究结果提示参苓散能通过启动 BDNF 的表达加强脑缺血后的内源性修复过程这可能是内服参苓散后机体 对脑进行保护作用的一种机制

AD   属中医学的“痴证”“呆病”等范畴中医学认为引起本病的基本原因是肝肾亏虚气血不足经脉失养髓海不足 而脾胃为后天化生之源脾胃气健则先天肾气充实髓海得养 参苓散方中人参大补元气以生中气健脾益肺以助运化   智 以充髓海;   更有茯苓协助利水渗湿调补脾阴益心脾而宁心 神炙甘草**补中调和诸药共奏健脾 神之功

 

4 参考文献

1 官志忠齐晓岚 . 阿尔茨海默病的分子发病机制及其研究进展

J.  中华病理学杂志2008; 37( 1) : 11-5.

2 Tesseur I,Van Dorpe J,Spittaels K,et al. Expression of human apoli- poprotein E4 in neurons causes hyperphosphorylation of protein tau in the brains of transgenic mice〔J〕. Am J Pathol,2000; 156( 3) : 951-64.

3 王少华 耿美玉 . 阿尔茨海默病的炎症病理机制及糖类物

4 质的**作用J.  生理科学进展2005; 36( 1) : 67-70.郝小燕 . 组分中药对 D-半乳糖联合1-40 致痴呆模型大鼠脑组织抗氧化能力的影响J.  时珍国医国药2012; 23 ( 10) : 2516-7.

5 Morris ,garrud P,awlins JN,et al. Place navigation impaired in rats with hippocampal lesions〔J〕.  Nature,1982; 297( 5868) : 681-3.

6 Amino S,Itakura M,Ohnishi H,et al.  Nerve growth factor enhances neu- rotransmitter release from PC12 cells by increasing Ca( 2 + ) -responsible secretory vesicles through the activation of mitogen-activated protein ki- nase and  phosphatidylinositol 3-kinase〔J〕.   J  Biochem,2002; 131 ( 6 ) : 887-94.

7 Yang JT,Chang  CN,Lee  TH,et  al.   Effect  of  dexamethasone  on  the  ex- pression of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 messen- ger ribonucleic acids after forebrain ischemia in the rat〔J〕 Crit Care Med,2002; 30( 4) : 913-8.

8 Hall  J,Thomas  KL,Everitt  BJ. Rapid  and  selective  induction  of  BNDF

expression in  the  hippocampus  during  contextual  learing. Nat  Neurosci 2000; 3( 6) : 533-5.

        〔2012-11-26 收稿 2013-02-12 修回

       ( 编辑 袁左鸣)

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