侯永春 严 孜1 ( 江西中医药大学，江西 南昌 330004)

〔摘    要〕 目的    观察参苓散对脾阴虚痴呆( AD) 大鼠海马区脑源性神经营养因子( BDNF) 、神经生长因子( NGF) 表达的影响。方法     将 48 只体重( 300 ± 20) g 的健康雄性大鼠，随机分成空白组( 空白对照) 、阴虚组( 脾阴虚) 、AD 组( 脾阴虚 + AD) 和 组( 脾阴虚 + AD ) ，每组 12 只。通过病证结合的方法建立脾阴虚 AD 大鼠模型，组给予中药参苓散灌胃，每日1 ml /100 g，持续10 d，其他各组每日予等体积生理盐水灌胃。采用Morris 水迷宫测试各组大鼠学习记忆能力，用疫组化( SP) 方法观察大鼠海马区BDNF 和NGF 的表达。结果     ①  造模后，阴虚组、AD 组、 组与空白组对比逃避潜伏期明显延长，穿越平台次数减少( P ＜ 0. 05 或 P ＜ 0. 01) ; 给予参苓散后，组与阴虚组、AD 组相比，大鼠逃避潜伏期明显缩短，穿越平台次数增多( P ＜ 0. 01) ; ②与空白组比较，阴虚组、AD 组大鼠海马 BDNF、NGF 表达明显下调( P ＜ 0. 01) ; 而组大鼠海马 BDNF、NGF 表达与阴虚组、AD 组比较明显上调( P ＜ 0. 01) 。结论 参苓散能改善脾阴虚 AD 模型大鼠的学习记忆能力，增加其海马区 BDNF、NGF 表达。

〔关键词〕 参苓散; 痴呆; 脑源性神经营养因子; 神经生长因子

〔中图分类号〕 Ｒ749 〔文献标识码〕 A 〔文章编号〕 1005-9202( 2014) 03-0728-03; doi: 10. 3969 / j. issn. 1005-9202. 2014. 03. 075

老年性痴呆( AD) 是一种枢神经系统退行性**，其进行性的认知功能障碍学习和记忆能力减退〔1〕。中医发现这一病症与脾虚湿胜、脑窍失养症状相似; 同时临床上也多用补脾益肾增智的方剂。参苓散具有益心力，除谬忘，能饮食，延年益寿的功效。近几年来发现大脑海马区神经因子数量减少和功能障碍在脾阴虚 AD 发生与发展中起到越来越重要的作用〔2〕。本研究观察参苓散对脾阴虚 AD 大鼠的学习记忆功能的改善作用，用疫组化( SP) 方法观察大鼠海马神经因子表达的变化，为防治脾阴虚 AD 病提供科学证据。

1 材料与方法

1. 1 材 料

1. 1. 1 动物 选用清洁级健康雄性 SD 大鼠 48 只，江西中医学院实验动物中心提供，合格证号 2011-50，体重( 300 ± 20) g，环境温度( 25 ± 2) ℃ ，自然昼夜节律，颗粒饲料饲养，自由饮水。

1. 1. 2    药品与试剂    参苓散( 药包括茯苓、人参、甘草等份自配，常规水煎，药液含生药 3. 2 g / ml) 和伤阴药( 吴茱萸、附子等，常规水煎，药液含生药 1 g / ml) 江西南华制药有限公司;   钠注射液，江西科伦药业有限公司;   3-氨丙基-3-乙氧基甲硅烷( APES) ; 抗兔 SP 试剂盒，中性磷酸盐缓冲溶液( PBS) ; 二氨基联苯胺( DAB) 显色剂( 均为中杉金桥) 。

1. 1. 3 仪器    2135 型石蜡切片机( Leica，德国) ，展片、烤片机( 山东红旗仪器厂，中国) ，DT10K 型电子天平( 江苏常熟长青仪器仪表厂，中国) ，恒温箱兼培养箱( 上海医用恒温设备厂， 中国) ，BX-41 型显微照相仪( OLYMOUS，日本) ，DB001 型 Mor- ris 水迷宫( 北京智鼠多宝生物科技有限责任公司，中国) 。

1. 2 方法

1. 2. 1    动物分组    48 只健康雄性大鼠称重后，随机分成四组: 空白组( 空白对照) 、阴虚组( 脾阴虚) 、AD 组( 脾阴虚 + AD) 和组( 脾阴虚 + AD +) ，每组 12 只。

1 江西中西药大学科技学院

**作者: 侯永春( 1979-) ，男，讲师，主要从事中药药理学研究。

1. 2. 2 动物模型复制及给药

1. 2. 2. 1 脾阴虚证模型 首先对阴虚组、AD 组和组大鼠参照经典的复合因素造模法〔3〕进行脾阴虚模型的建立，分为脾气虚和脾阴虚两个阶段。实验第 1 ～ 15 天为脾气虚阶段，大鼠单日自由游泳达到耐力极限，禁食饲料，喂甘兰( 30 g / 只) ; 双日予猪油脂灌服; 空白组正常喂养，予等量生理盐水灌服。第 16 ～ 24 天为脾阴虚阶段，在脾气虚的基础上每日增加伤阴药 1 ml /100 g ，连续灌服。而空白组大鼠仅予等体积生理盐水灌服。

1. 2. 2. 2 脾阴虚 + AD 模型 AD 组、组大鼠继续进行AD 模型〔4〕的建立，用 MILLIQ 水将 Aβ1 ～ 40稀释成 5 μg / μl，37℃ 孵育1 w，使其变为聚集状态备用。大鼠经腹腔注射2%    钠( 45 mg / kg) 麻醉后，固定到脑立体定位仪，常规备皮**，切开皮肤; 选择双侧海马为注射靶区，取前囟后 3. 5 mm ， 中线旁 2. 0 m ，门齿钩平面低于耳间线平面 3. 3 mm 处钻开颅骨，暴露硬脑膜，微量注射器自脑表面缓慢垂直进针至硬脑膜下2. 5 mm，AD 各组每侧予以2 μl 淀粉样蛋白酶( Aβ1 ～ 40 ) 溶液缓慢注入，留针以保证溶液充分弥散，缓慢撤针，缝合切口，皮下注射抗生 防止感染; 空白组和阴虚组大鼠进行同样手术， 仅注入等体积 MILLIQ 水，术后继续喂养。

1. 2. 3 药干预 术后第 4 天对组大鼠给予中药参苓散灌胃，每日 1  ml /100  g，持续 10  d，而其余各组大鼠每日予等体积生理盐水灌胃。

1. 2. 4  Morris 水迷宫试验   采用 Morris 水迷宫测试各组大鼠造模前、造模后、后学习记忆能力; 具体方法参照 Morris 等〔5〕的方法，分别于 AD 造模术前、造模术后第 3 天及结束后评价各组大鼠逃避潜伏期、穿越平台的次数。

1. 2. 5  标本制备  各组大鼠在进行行为学测试结束后，立即以致死量 100 g / L 水合氯醛( 350 mg / kg) 腹腔麻醉后，仰卧位固定于手术台上，剪开胸腔，暴露心脏，从心尖插入灌注针至左心室，同时剪开右心耳，快速滴入 37℃ 生理盐水 300  ml，无血污后改为滴入固定液 4℃ 的多聚甲醛 400 ml。待大鼠尾巴完全僵直时迅速断头，取出海马组织，固定于 4% 多聚甲醛溶液中 12 ～24  h，进行脱水透明及石蜡包埋。冠状面连续切片，厚度约3  μm，用经多聚赖氨酸处理过的载玻片捞片，晾干后置于 60℃的烤箱中烘烤备用。

1. 2. 6 脑源性神经营养因子(  BDNF) 、神经生长因子(  NGF)  疫组化检测     采用 疫组化 SP 法检测 BDNF 及 NGF 的表达，严格按照试剂说明书操作要求进行检测。在海马区随机选择 8 个视野，用显微图像分析系统下的目镜，400 倍显微计数，计算阳性细胞数平均数。

1. 3  统计学方法   应用 SPSSV11. 5 软件进行分析，计量资料以 x ± s 表示，组间两两比较采用多组定量资料的单因素方差分析 LSD 法。

2 结 果

2. 1 定位航行试验      造模前各组大鼠定位航行试验逃避潜伏期无统计学差异( P ＞ 0. 05) ，具有可比性; 造模后，阴虚组、AD 组、组与空白组对比逃避潜伏期明显延长( P ＜ 0. 05 或P ＜ 0. 01) 。给予中药参苓散灌胃后，与阴虚组、AD 组相比，组逃避潜伏期明显缩短( P ＜ 0. 05) 。见表 1。

 2. 2    空间探索试验     造模前各组大鼠空间探索试验穿越平台次数无统计学差异( P ＞ 0. 05) ，且有可比性。造模后，阴虚组、AD 组、组与空白组对比穿越平台次数明显减少( P ＜0. 01) ; 其中组、AD 组与阴虚组比较，穿越平台次数明显减少( P ＜ 0. 01) 。给予中药参苓散灌胃后，与阴虚组、AD 组相比，组穿越平台次数明显增加( P ＜ 0. 01) 。见表 2。

2. 3  各组大鼠 BDNF、NGF 表达情况   与空白组比较，阴虚组、AD 组大鼠海马 BDNF、NGF 表达明显下调( P ＜ 0. 01) ; 而组与阴虚组、AD 组比较明显上调( P ＜ 0. 01) 。见表 3、图 1。

    3 讨 论

AD 呈逐年上升的趋势，至今还没有令人满意的方法， 中** AD 给人们提出了新思路。本研究结果表明参苓散灌服能够明显提高脾阴虚 AD 大鼠的学习和记忆能力，改善认知功能。

海马结构作为大脑边缘系统的重要组成部分，在学习和记 忆等上等神经活动中起关键作用，海马神经元损害可能是 AD 的重要病理基础之一。神经营养因子是一类对神经有特异性的蛋白质，BDNF 和 NGF 就是其中的代表。随着对其深入研究，人们发现它们具有明确的促进和维持神经细胞分化、生长 和存活作用，在改善认知功能方面也有重要作用〔6 ～ 8〕。但中药方参苓散能否促进慢性脑缺血大鼠 BNF 的表达，目前国内外未见报道。本研究结果提示参苓散能通过启动 BDNF 的表达加强脑缺血后的内源性修复过程，这可能是内服参苓散后机体 对脑进行保护作用的一种机制。

AD   属中医学的“痴证”、“呆病”等范畴，中医学认为引起本病的基本原因是肝肾亏虚、气血不足、经脉失养、髓海不足。 而脾胃为后天化生之源，脾胃气健则先天肾气充实，髓海得养。 参苓散方中人参大补元气，以生中气，健脾益肺，以助运化，益   智 神，以充髓海;   更有茯苓协助利水渗湿，调补脾阴，益心脾而宁心 神，炙甘草**补中，调和诸药，共奏健脾 神之功。

4 参考文献

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〔J〕.  中华病理学杂志，2008; 37( 1) : 11-5.

2 Tesseur I，Van Dorpe J，Spittaels K，et al. Expression of human apoli- poprotein E4 in neurons causes hyperphosphorylation of protein tau in the brains of transgenic mice〔J〕. Am J Pathol，2000; 156( 3) : 951-64．

3 王少华，李 静，耿美玉 . 阿尔茨海默病的炎症病理机制及糖类物

4 质的**作用〔J〕.  生理科学进展，2005; 36( 1) : 67-70.郝小燕，周 蕾，叶 兰，等 . 组分中药对 D-半乳糖联合 Aβ₁-₄₀ 致痴呆模型大鼠脑组织抗氧化能力的影响〔J〕.  时珍国医国药，2012; 23 ( 10) : 2516-7.

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6 Amino S，Itakura M，Ohnishi H，et al.  Nerve growth factor enhances neu- rotransmitter release from PC12 cells by increasing Ca( 2 + ) -responsible secretory vesicles through the activation of mitogen-activated protein ki- nase and  phosphatidylinositol 3-kinase〔J〕.   J  Biochem，2002; 131 ( 6 ) : 887-94.

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8 Hall  J，Thomas  KL，Everitt  BJ． Ｒapid  and  selective  induction  of  BNDF

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        〔2012-11-26 收稿 2013-02-12 修回〕

       ( 编辑 袁左鸣)