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老鼠实验-塞来昔布联合吉西他滨动脉灌注抑制人肺癌A549细胞移植瘤的研究

塞来昔布联合吉西他滨动脉灌注抑制人肺癌 A549 细胞移植瘤的研究

何 阳赵保成刘洪强王赛博郑晓辉曹 军

( 上海市徐汇区大华医院上海 200237)

 摘要  目的  研究塞来昔布联合吉西他滨经动脉灌注抑制人肺癌 A549 细胞移植瘤的作用方法  人肺癌 A549 细胞系经传代培养后移植于 40 只祼大鼠建立肺癌裸大鼠模型将荷瘤鼠均分为假手术组吉西他滨组塞来昔布组联合组假手术组动脉注入生理盐水 0 2 mL吉西他滨组塞来昔布组分别经动脉灌注吉西他滨 100 mg / kg 及塞来昔布 25 mg / kg。联合组灌注吉西他滨 100 mg / kg + 塞来昔布 25 mg / kg。观察干预前后各组大鼠肿瘤体积的变化计算荷瘤鼠的抑瘤率流式细胞仪检测细胞的凋亡率采用 Western blot 法检测各组Bcl 以及 Caspase  3 表达情况结果 吉西他滨组塞来昔布组和联合组的抑瘤率分别为 54 18% 49 52% 和 88 59% ; 联合组移植瘤组织的 Bcl  2 表达量均低于其他 3 组( P 均 0 05) Caspase  3 表达量及凋亡指数均高于其他 3 组( P 均  0 05) 结论    塞来昔布与吉西他滨动脉灌注都能抑制肺癌裸大鼠移植瘤的生长二者联合应用效果更好诱导细胞凋亡是两者协同抗肿瘤作用的机制

关键词 塞来昔布; 吉西他滨; 动脉灌注化疗; 肺癌doi: 10. 3969 / j. issn. 1008 - 8849. 2015. 32. 003

中图分类号    332 文献标识码   A 文章编号 1008  8849( 2015) 32  3542  04


肺癌是临床常见的恶性肿瘤之一肺癌患者 5 年的生存率仅为 16 1% 在癌症死亡患者中肺癌是男性**死亡因素是女性第三死亡因素因此积极探寻有效的**方式成为研究重点1]环氧合酶 2 ( COX 2) 不仅能够促进肿瘤血管和**管形成抑制肿瘤细胞凋亡而且对促进肿瘤细胞生转移及将前致癌物质转化为致癌物质有主导作用动物 试验表明选择性 COX 2 抑制剂塞来昔布灌胃可抑制裸鼠移植瘤的生长2]还有试验报道第三代化疗药吉西他滨应 用于中晚期肺癌的介入化疗中不仅能够直接杀灭恶性肿瘤 细胞同时可抑制肿瘤血管生成发挥间接抗肿瘤作用且近 期有效率高于第三代静脉化疗方案3]但是关于塞来昔布联合吉西他滨动脉灌注抑制人肺癌 A549 细胞移植瘤的实验研究尚少见为此笔者以体外实验方法进行了研究旨在为今 后从分子角度采用此种方式**肺癌奠定基础

1 实验资料

1. 1   材料    人肺癌 A549( 上海市肿瘤研究所) 。SPF 级裸大 40 只BALB / C 裸小鼠 4 只( 北京智鼠多宝公司) ,动物合格证 SYXK( 沪) 2007  0001裸大鼠体质量( 180 ± 15) g 10 周龄雌雄各半; 裸小鼠体质量( 22 1 ± 2 1) g 5 周龄雌雄各半饲养相对湿度 40% 50% ,温度 22 25 ℃ ,摄食饮水自由同等塞来昔布(  辉瑞公司) ,吉西他滨(  豪森药业) 。Annexin V FITC / PI 凋亡试剂盒( 上海炎彬化工科技有限公司) ; ECL 试剂盒( BestBIO 公司) ,半胱氨酸蛋白 ( Caspase)   3B **细胞瘤( Bcl)   2GAPDH  抗体( Santa cruz) ,鼠抗人二抗( 碧云天) 。

1. 2

1. 2. 1 细胞培养 将人肺癌 A549 细胞复苏用含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养液培养取生长良好的细胞用 0 25% 胰蛋白酶消化离心收集细胞用 1 mL  PBS 稀释成 5 × 106 mL  1 以 0 2 mL 接种于 4 只 BALB / C 裸小鼠右腋皮下( 因为裸小鼠接种成瘤容易直接用肺癌细胞株接种裸大鼠成瘤困所以先接种裸小鼠取得足够量肿瘤组织)  ,待肿瘤长至体积约为10 mm × 10 mm × 10 mm 时移植于裸大鼠耳后造模

1. 2. 2    造模分组    将瘤结无破溃生长良好的腋下接种荷瘤裸小鼠 4 只处死无菌条件下剥离瘤结**坏死组织在生理盐水中将瘤结反复剪切为 2 mm × 2 mm × 2 mm 大小的瘤组织块然后接种于裸大鼠右耳后皮下肿瘤于 8 d 后接种成功肿瘤生长 3 周后体积 2 650 2 800 mm3 对荷瘤裸大鼠根据性别分层后分为假手术组吉西他滨组塞来昔布组联合每组 10 只

1. 2. 3    给**法    用 10% 水合氯醛 3 5 g / kg 腹腔麻醉各组荷瘤大鼠颈部正中皮肤切开暴露右颈动脉; 采用改良Seldinger 技术将静脉留置针插入右颈动脉先在臂机 DSA 下使用稀释的碘克沙醇 0 2 mL 行手推动脉造影诊断肿瘤的供血动脉并明确肿瘤的显影情况; 再经导管灌注**或盐水 缓慢推注灌注时间 30 s随后缝合皮肤假手术组经导管注入生理盐水 0 2 mL吉西他滨组予吉西他滨 100 mg / kg 导管灌注塞来昔布组予塞来昔布 25 mg / kg 导管灌注联合组予吉西他滨 100 mg / kg塞来昔布 25 mg / kg 导管灌注

1. 2. 4     肿瘤体积及抑瘤率测量方法     采用游标卡尺测量肿瘤长短径肿瘤体积( mm3 )  = 肿瘤长径 × 肿瘤短径2 /2用药后第16 天处死各组大鼠取出皮下肿瘤称质量抑瘤率  = ( 1 **组瘤质量/ 荷瘤假手术组瘤质量)  × 100% 计算 Q 值并判断两药的联合效应4]: E( A + B) 设为两药联用抑瘤率 EA 和EB 为各单药抑瘤率 Q = E( A + B) /[EA + ( 1 EA) × EBQ 值 0 85  1 15 提示两药作用相加 1 15 提示两药协同 0 85 提示两药拮抗

1. 2. 5 组织检测 取新鲜瘤组织 10% 甲醛溶液固定后 将肿瘤组织制成单细胞悬液离心去除细胞碎片收集细胞

( 每组至少1 × 106 个细胞) , Annexin V  FITC / PI 凋亡试剂盒说明书操作流式细胞仪检测移植瘤细胞凋亡率苏木素   伊红( HE) 染色检测各组肿瘤细胞形态; Western blot 法检测Bcl  Caspase  3 表达水平: SDS  PAGE 分离胶电泳; 4% SDS  PAGE  浓缩胶电泳PVDF  膜半干转 100  V30  min 5% 脱脂奶粉封闭过夜一抗 1 ∶ 1 000 过夜二抗 1 ∶ 5 000 孵 1 h按操作试剂盒说明操作

1. 3    统计学方法    数据处理使用 SPSS 13 0 统计软件计量资料以 x珋± s 表示组间比较采用 t 检验P  0 05 为差异有统计学意义

2. 1 裸大鼠情况  40 只裸大鼠实验完成时均存活饮水进食活动状态良好各组手术切口**好均未见感染

2. 2 各组荷瘤鼠肿瘤体积比较 各组移植瘤**前体积比较差异无统计学意义( P 均  0 05) **后吉西他滨组塞来昔布组联合组肿瘤体积均小于假手术组( P 均  0 05) 吉西他滨组肿瘤体积小于塞来昔布组( P 均  0 05) 联合组小于吉西他滨组和塞来昔布组( P 均  0 05) 见表 1

 2. 3 各组移植瘤质量及抑瘤率比较 吉西他滨组塞来昔布组联合组移植瘤质量均明显低于假手术组( P 均  0 05 ) 联合组明显低于吉西他滨组塞来昔布组( P 均  0 05) ; 联合组抑瘤率明显高于吉西他滨组塞来昔布组其 Q 值  1 15见表 2

2. 4   各 Bcl  2 和 Caspase  3 蛋白表达情况 假手术组Bcl  2 蛋白相对表达量为 1 20 ± 0 09吉西他滨组为 0 67 ± 0 15塞来昔布组为 0 80 ± 0 07联合组为 0 26 ± 0 08联合组 Bcl  2 表达量明显低于其余 3 组( P 均  0 05) 吉西他滨组及塞来昔布组明显低于假手术组( P 均  0 05) 假手术组 Caspase  3 蛋白相对表达量为 0 53 ± 0 05吉西他滨组为 0 . 99 ± 0  06 塞来昔布组为0  87 ± 0  03 联合组为1  46 ±0. 18吉西他滨组及塞来昔布组 Caspase  3 蛋白表达量明显高于假手术组( P 均  0 05) 联合组 Caspase  3 蛋白表达量明显高于其余 3 组( P 均  0 05) 

 2. 5 各组肿瘤组织 HE 染色表现  假手术组未见明显细胞凋亡表现见图 1; 吉西他滨组可见凋亡细胞致密浓缩核染色质凋亡小体形成核碎裂可见较多空泡见图 2; 塞来昔布组可见相应的凋亡表现见图 3; 联合组上述核碎裂及空泡更加明显见图 4

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