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北京智鼠多宝生物科技有限责任公司
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模式动物显微注射介绍及常用工具

一、模式动物
随着人类基因组计划的完成和后基因组研究时代的到来,模式生物的研究策略得到了广泛的应用,基因的结构和功能可以在其它合适的生物中去研究,同样人类的生理和病理过程也可以选择合适的生物来模拟,在科研领域,常见的模式动物除开广泛应用的大小鼠外,还有斑马鱼,非洲爪蟾,果蝇,线虫应用*为广泛。由于他们各自独特的优点,被应用于遗传学的研究、发育生物学的基因调控的研究、各类**的研究如帕金森氏病、老年痴呆症、**成瘾和酒精中毒、衰老与长寿、学习记忆与某些认知行为的研究。

1、斑马鱼

 
脊索动物门( Chordata)、辐鳍鱼纲(Actinopterygii)、鲤形目(Cypriniformes)、鲤科(Cyprinidae)鱼丹属(Danio)斑马鱼(D. rerio)。体长 4~6 厘米。体呈纺锤形。背部橄榄色,体侧从鳃盖后直伸到尾未有数条银蓝色纵纹,臀鳍部也有与体色相似的纵纹,尾鳍长而呈叉形。雄鱼柠檬色纵纹;雌鱼蓝色纵纹加银灰色纵纹。斑马鱼模式生物的使用正逐渐拓展和深入到生命体的多种系统(例如,神经系统、**系统、心血管系统、生殖系统等)的发育、功能和** (例如,神经退行性**、遗传性心血管**、糖尿病等)的研究中,并已应用于小分子化合物的大规模新药筛选。斑马鱼作为模式动物的优点如下:
 
(1)斑马鱼的繁殖周期约 7 天左右,一年可连续繁殖 6-7 次,而且产卵量高其繁殖力很强。
 
(2)由于斑马鱼基因与人类基因的相似度达到 87%,这意味着在其身上做**实验所得到的结果在多数情况下也适用于人体,因此它受到生物学家的重视。
 
(3)斑马鱼的胚胎是透明的,所以生物学家很容易观察到**对其体内器官的影响。
 
(4)雌性斑马鱼可产卵 200 枚,胚胎在 24 小时内就可发育成形,这使得生物学家可以在同一代鱼身上进行不同的实验,进而研究病理演化过程并找到病因。 

2、非洲爪蟾 

 
 属脊索动物门 (Phylum Chordata)、无尾目 (Salientia)、负子蟾科 (Pipidae) 雄性成蛙体长 7-11 cm,雌性成蛙体长 9-14 cm。性成熟的成蛙前肢有黑色婚垫,便于交配,雄蛙泄殖腔比雌蛙泄殖腔小。非洲爪蟾学名 Xenopus laevis 负子蟾科。由于没有舌头只能利用其前肢搅食水中的无脊椎动物 。分布于由南非的热带草原起,北至肯尼亚,乌干达西至喀麦隆。体长 100 mm。雄性会比雌性小一截,后肢具有 3 对角质脚爪。非洲爪蟾作为模式动物的优点如下:
(1)在胚胎学研究中,非洲爪蟾是主要的两栖类动物模型。非洲爪蟾的优势在于取卵方便,在实验室条件下,它可以常年只要注射**,雌体第 2 天就可以产卵,而且产卵量很大,可以通过人工授精获得受精卵。
 
(2)非洲爪蟾的卵子和胚胎个体较大,非常适宜于进行实验胚胎学研究,如显微注射、胚胎切割和移植等。其早期胚胎发育很快,在 24℃ 下受精后 2 天左右就可以孵化成可以自由游动的幼虫。
 
(3)非洲爪蟾的成熟卵子具有明确的动物极和植物极,受精作用引起皮质运动。爪蟾胚胎经过卵裂、囊胚、原肠胚、神经胚、尾芽期等阶段孵化成幼虫;蝌蚪在 5 天左右后肢开始发育并逐渐进入变态期,到两个月时完成变态。幼体要生长 1 到 2 年才能达到性成熟。产卵,不受季节限制。 

3、果蝇(Drosophila,fruit fly, Drosophila melanogaster)


属节肢动物门、昆虫纲、双翅目、果蝇属、果蝇种。约 1,000 种。广泛用作遗传和演化的室内外研究材料,尤其是黄果蝇 (D. melanogaster)。果蝇作为模式动物的优点如下:

(1)饲养容易,用一只牛奶瓶,放一些捣烂的香蕉,就可以饲养数百甚至上千只果蝇;
 
(2)繁殖快,在 25℃ 左右温度下十天左右就繁殖一代,一只雌果蝇一代能繁殖数百只。果蝇只有四对染色体,数量少而且形状有明显差别;
 
(3)果蝇性状变异很多,比如眼睛的颜色、翅膀的形状等性状都有多种变异,这些特点非常有利于遗传学研究。
 
4、线虫
亦称圆虫 (roundworm)。属线虫动物门 (Aschelminthes) 线虫纲 (Nematoda) 所有蠕虫的通称,系动物界中数量*丰者之一,寄生于动、植物,或自由生活于土壤、淡水和海水环境中。通常呈乳白、淡黄或棕红色。大小差别很大,小的不足 1 毫米,大的长达 8 米。线虫作为模式动物的优点如下:
 
(1)线虫生活在土壤间水层,成虫体全长只有 0.1 公分,因以**为食物,所以在实验室中极易培养。
 
(2)线虫全身透明,研究时不需染色,即可在显微镜下看到线虫体内的器官如肠道、生殖腺等;若使用高倍相位差显微镜,还可达到单一细胞的分辨率。因此,线虫是研究细胞分裂、分化、死亡等的好材料。又因为线虫仅有一千多个体细胞,所以它的所有细胞都可以彻底地观察研究。
 
二、注射流程举例(以斑马鱼胚胎显微注射为例)
 
注射步骤:
 
1、注射针内装液:使用无菌的微量加样器从微注射针的后部加入待注射样品酚红一滴。
 
2、注射针安装和定位:
 
(1) 将装液后的针头的游离端安在连接器上,然后旋紧连接器以固定针头,再将其固定到微操作仪的托针管上;
 
(2) 把载有待注射样本的培养皿放在显微镜载物台上,用低倍物镜对准细胞调焦;
 
(3)移动针头并在显微镜下调整微操作仪,直到针头的阴影在视野的中心上方;
 
(4)使用工作用放大倍数,调准细胞焦距,找到针尖。
 
3、显微注射:
 
(1)使针尖对准细胞的待注射部位(细胞与针尖在同一焦面上),旋转推进旋钮,针刺入细胞内(卵膜、细胞膜、核膜);
 
(2)旋转加样旋钮,将样本加入,并离开细胞。
实验结果:
 

 
、模式动物胚胎操作相关的显微注射设备
在应用模式动物(斑马鱼,非洲爪蟾,果蝇,线虫等)进行相关胚胎操作过程中,需要使用高效可靠的显微注射设备。根据注射驱动动力的不同,常见的系统包含液体压力式注射系统以及气压式注射系统
 
1、液体压力式注射系统
该系统由液体压力注射主机,控制器,手动三维位操作器,磁性底座以及固定铁板组成。待注射样本溶液(如 RNA)被机械推动的液体压力推出针尖进口卵母细胞胞内。经典的系统如美国 Harvard Apparatus 公司的 Nanoject 纳升级注射系统。如下图:

 
2、气压式注射系统
该系统由液体压力注射主机,控制器,手动三维位操作器,磁性底座以及固定铁板组成。待注射样本溶液(如 RNA)被**可控的气体压力推出针尖进口卵母细胞胞内。

 

 

 
3、用于光遗传实验过程中的慢病毒注射的系统
以病毒转染光敏蛋白为方法的光遗传实验同样也需要微注射过程,将病毒以很慢的速度注射到大小鼠的脑区。这就需要推进精度很高的微注射系统,如哈佛公司的注射泵等。

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