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模式动物显微注射介绍及常用工具

一、模式动物
随着人类基因组计划的完成和后基因组研究时代的到来,模式生物的研究策略得到了广泛的应用,基因的结构和功能可以在其它合适的生物中去研究,同样人类的生理和病理过程也可以选择合适的生物来模拟,在科研领域,常见的模式动物除开广泛应用的大小鼠外,还有斑马鱼,非洲爪蟾,果蝇,线虫应用最为广泛。由于他们各自独特的优点,被应用于遗传学的研究、发育生物学的基因调控的研究、各类疾病的研究如帕金森氏病、老年痴呆症、药物成瘾和酒精中毒、衰老与长寿、学习记忆与某些认知行为的研究。

1、斑马鱼

 
脊索动物门( Chordata)、辐鳍鱼纲(Actinopterygii)、鲤形目(Cypriniformes)、鲤科(Cyprinidae)鱼丹属(Danio)斑马鱼(D. rerio)。体长 4~6 厘米。体呈纺锤形。背部橄榄色,体侧从鳃盖后直伸到尾未有数条银蓝色纵纹,臀鳍部也有与体色相似的纵纹,尾鳍长而呈叉形。雄鱼柠檬色纵纹;雌鱼蓝色纵纹加银灰色纵纹。斑马鱼模式生物的使用正逐渐拓展和深入到生命体的多种系统(例如,神经系统、免疫系统、心血管系统、生殖系统等)的发育、功能和疾病 (例如,神经退行性疾病、遗传性心血管疾病、糖尿病等)的研究中,并已应用于小分子化合物的大规模新药筛选。斑马鱼作为模式动物的优点如下:
 
(1)斑马鱼的繁殖周期约 7 天左右,一年可连续繁殖 6-7 次,而且产卵量高其繁殖力很强。
 
(2)由于斑马鱼基因与人类基因的相似度达到 87%,这意味着在其身上做药物实验所得到的结果在多数情况下也适用于人体,因此它受到生物学家的重视。
 
(3)斑马鱼的胚胎是透明的,所以生物学家很容易观察到药物对其体内器官的影响。
 
(4)雌性斑马鱼可产卵 200 枚,胚胎在 24 小时内就可发育成形,这使得生物学家可以在同一代鱼身上进行不同的实验,进而研究病理演化过程并找到病因。 

2、非洲爪蟾 

 
 属脊索动物门 (Phylum Chordata)、无尾目 (Salientia)、负子蟾科 (Pipidae) 雄性成蛙体长 7-11 cm,雌性成蛙体长 9-14 cm。性成熟的成蛙前肢有黑色婚垫,便于交配,雄蛙泄殖腔比雌蛙泄殖腔小。非洲爪蟾学名 Xenopus laevis 负子蟾科。由于没有舌头只能利用其前肢搅食水中的无脊椎动物 。分布于由南非的热带草原起,北至肯尼亚,乌干达西至喀麦隆。体长 100 mm。雄性会比雌性小一截,后肢具有 3 对角质脚爪。非洲爪蟾作为模式动物的优点如下:
(1)在胚胎学研究中,非洲爪蟾是主要的两栖类动物模型。非洲爪蟾的优势在于取卵方便,在实验室条件下,它可以常年只要注射激素,雌体第 2 天就可以产卵,而且产卵量很大,可以通过人工授精获得受精卵。
 
(2)非洲爪蟾的卵子和胚胎个体较大,非常适宜于进行实验胚胎学研究,如显微注射、胚胎切割和移植等。其早期胚胎发育很快,在 24℃ 下受精后 2 天左右就可以孵化成可以自由游动的幼虫。
 
(3)非洲爪蟾的成熟卵子具有明确的动物极和植物极,受精作用引起皮质运动。爪蟾胚胎经过卵裂、囊胚、原肠胚、神经胚、尾芽期等阶段孵化成幼虫;蝌蚪在 5 天左右后肢开始发育并逐渐进入变态期,到两个月时完成变态。幼体要生长 1 到 2 年才能达到性成熟。产卵,不受季节限制。 

3、果蝇(Drosophila,fruit fly, Drosophila melanogaster)


属节肢动物门、昆虫纲、双翅目、果蝇属、果蝇种。约 1,000 种。广泛用作遗传和演化的室内外研究材料,尤其是黄果蝇 (D. melanogaster)。果蝇作为模式动物的优点如下:

(1)饲养容易,用一只牛奶瓶,放一些捣烂的香蕉,就可以饲养数百甚至上千只果蝇;
 
(2)繁殖快,在 25℃ 左右温度下十天左右就繁殖一代,一只雌果蝇一代能繁殖数百只。果蝇只有四对染色体,数量少而且形状有明显差别;
 
(3)果蝇性状变异很多,比如眼睛的颜色、翅膀的形状等性状都有多种变异,这些特点非常有利于遗传学研究。
 
4、线虫
亦称圆虫 (roundworm)。属线虫动物门 (Aschelminthes) 线虫纲 (Nematoda) 所有蠕虫的通称,系动物界中数量最丰者之一,寄生于动、植物,或自由生活于土壤、淡水和海水环境中。通常呈乳白、淡黄或棕红色。大小差别很大,小的不足 1 毫米,大的长达 8 米。线虫作为模式动物的优点如下:
 
(1)线虫生活在土壤间水层,成虫体全长只有 0.1 公分,因以细菌为食物,所以在实验室中极易培养。
 
(2)线虫全身透明,研究时不需染色,即可在显微镜下看到线虫体内的器官如肠道、生殖腺等;若使用高倍相位差显微镜,还可达到单一细胞的分辨率。因此,线虫是研究细胞分裂、分化、死亡等的好材料。又因为线虫仅有一千多个体细胞,所以它的所有细胞都可以彻底地观察研究。
 
二、注射流程举例(以斑马鱼胚胎显微注射为例)
 
注射步骤:
 
1、注射针内装液:使用无菌的微量加样器从微注射针的后部加入待注射样品酚红一滴。
 
2、注射针安装和定位:
 
(1) 将装液后的针头的游离端安在连接器上,然后旋紧连接器以固定针头,再将其固定到微操作仪的托针管上;
 
(2) 把载有待注射样本的培养皿放在显微镜载物台上,用低倍物镜对准细胞调焦;
 
(3)移动针头并在显微镜下调整微操作仪,直到针头的阴影在视野的中心上方;
 
(4)使用工作用放大倍数,调准细胞焦距,找到针尖。
 
3、显微注射:
 
(1)使针尖对准细胞的待注射部位(细胞与针尖在同一焦面上),旋转推进旋钮,针刺入细胞内(卵膜、细胞膜、核膜);
 
(2)旋转加样旋钮,将样本加入,并离开细胞。
实验结果:
 

 
、模式动物胚胎操作相关的显微注射设备
在应用模式动物(斑马鱼,非洲爪蟾,果蝇,线虫等)进行相关胚胎操作过程中,需要使用高效可靠的显微注射设备。根据注射驱动动力的不同,常见的系统包含液体压力式注射系统以及气压式注射系统
 
1、液体压力式注射系统
该系统由液体压力注射主机,控制器,手动三维位操作器,磁性底座以及固定铁板组成。待注射样本溶液(如 RNA)被机械推动的液体压力推出针尖进口卵母细胞胞内。经典的系统如美国 Harvard Apparatus 公司的 Nanoject 纳升级注射系统。如下图:

 
2、气压式注射系统
该系统由液体压力注射主机,控制器,手动三维位操作器,磁性底座以及固定铁板组成。待注射样本溶液(如 RNA)被精确可控的气体压力推出针尖进口卵母细胞胞内。

 

 

 
3、用于光遗传实验过程中的慢病毒注射的系统
以病毒转染光敏蛋白为方法的光遗传实验同样也需要微注射过程,将病毒以很慢的速度注射到大小鼠的脑区。这就需要推进精度很高的微注射系统,如哈佛公司的注射泵等。

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